QuantScript RT ნაკრები

A-1 RNA არის დეგრადირებული

—— გაწმინდეთ მაღალი ხარისხის რნმ დაბინძურების გარეშე. მასალა, საიდანაც RNA არის მოპოვებული, უნდა იყოს რაც შეიძლება ახალი, რათა თავიდან აიცილოს რნმ -ის დეგრადაცია. გააანალიზეთ რნმ -ის მთლიანობა დენატურირებულ გელზე RT რეაქციამდე. რნმ -ის მოპოვების შემდეგ ის უნდა ინახებოდეს 100% ფორმამიდში. თუ RNase ინჰიბიტორი გამოიყენება, გათბობის ტემპერატურა უნდა იყოს <45 ° C, ხოლო pH უნდა იყოს 8.0 -ზე ნაკლები, წინააღმდეგ შემთხვევაში ინჰიბიტორი გამოყოფს ყველა შეკრული RNase- ს. უფრო მეტიც, RNase ინჰიბიტორი უნდა დაემატოს solutions 0.8 მმ DTT შემცველ ხსნარებს.

A-2 რნმ შეიცავს საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციების ინჰიბიტორებს

—— საპირისპირო ტრანსკრიფციის ინჰიბიტორები მოიცავს SDS, EDTA, გლიცეროლი, ნატრიუმის პიროფოსფატი, სპერმიდინი, ფორმამიდი, გუანიდინის მარილი და ა.შ. დაიბანეთ RNA ნალექი 70% (v/v) ეთანოლით ინჰიბიტორების მოსაშორებლად.

A-3 პრაიმერების არასაკმარისი ანელირება, რომელიც გამოიყენება cDNA– ის პირველი ნაწილის სინთეზისათვის

—— დაადგინეთ, რომ გაცხელების ტემპერატურა შესაფერისია ექსპერიმენტში გამოყენებული პრაიმერებისათვის. შემთხვევითი ჰექსამერებისთვის, რეკომენდებულია ტემპერატურის 25 ° C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში რეაქციის ტემპერატურის მიღწევამდე. გენის სპეციფიკური პრაიმერებისათვის (GSP), სცადეთ სხვა GSP, ან გადახვიდეთ ოლიგოზე (dT) ან შემთხვევით ჰექსამერზე.

A-4 მცირე რაოდენობით დაწყებული რნმ

—— გაზარდეთ რნმ – ის რაოდენობა. რნმ -ის ნიმუშებისთვის 50 ნგ -ზე ნაკლები, 0.1 მკგ 0.5 მკგ აცეტილ BSA შეიძლება გამოყენებულ იქნას პირველი ძაფის cDNA სინთეზში

A-5 სამიზნე მიმდევრობა არ არის გამოხატული გაანალიზებულ ქსოვილებში.

---- სცადეთ სხვა ქსოვილები.

A-6 PCR რეაქცია ვერ ხერხდება

—— ორეტაპიანი RT-PCR– ისთვის, cDNA შაბლონი PCR საფეხურზე არ შეიძლება აღემატებოდეს რეაქციის მოცულობის 1/5.

A-1 პრაიმერებისა და შაბლონების არასპეციფიკური ანელირება

პრაიმერის 3'-ბოლო არ უნდა შეიცავდეს 2-3 დგ ან დკ. გამოიყენეთ გენის სპეციფიკური პრაიმერები პირველი ძაფის სინთეზში შემთხვევითი პრაიმერის ან ოლიგო (dT) ნაცვლად. გამოიყენეთ უფრო მაღალი გამაცხელებელი ტემპერატურა პირველ რამოდენიმე ციკლში და შემდეგ უფრო დაბალი ტემპერატურა. გამოიყენეთ ცხელი დაწყების Taq დნმ პოლიმერაზა PCR– სთვის რეაქციის სპეციფიკის გასაუმჯობესებლად.

A-2 გენის სპეციფიკური პრაიმერების ცუდი დიზაინი

--— დაიცავით იგივე პრინციპები გამაძლიერებელი პრაიმერის დიზაინისთვის.

A-3 რნმ დაბინძურებულია გენომური დნმ-ით

—— მკურნალობა რნმ – ით PCR კლასის DNase I. შეიქმენით საკონტროლო რეაქცია საპირისპირო ტრანსკრიფციის გარეშე დნმ – ის დაბინძურების გამოსავლენად.

A-4 პრაიმერის დიმერის ფორმირება

—— შეიმუშავეთ პრაიმერები დამატებითი თანმიმდევრობების გარეშე 3 ’ბოლოს.

A-5 ძალიან მაღალი მგ²⁺ კონცენტრაცია

—— ოპტიმიზაცია მგ²⁺ კონცენტრაცია თითოეული შაბლონისა და პრაიმერის კომბინაციისთვის

A-6 დაბინძურებულია უცხო დნმ-ით

—— გამოიყენეთ აეროზოლური რეზისტენტული რჩევები და UDG ფერმენტები.

A-1 პირველი ძაფის პროდუქტის შემცველობა ძალიან მაღალია

—— შეამცირეთ პირველი ძაფის პროდუქტის რაოდენობა ჩვეულებრივი PCR რეაქციის საფეხურზე.

A-2 ძალიან მაღალი პრაიმერის რაოდენობა PCR რეაქციაში

--— შეამცირეთ პრაიმერის შეყვანა.

A-3 ძალიან ბევრი ციკლი

—— PCR რეაქციის პირობების ოპტიმიზაცია და PCR ციკლის რაოდენობის შემცირება.

A-4 გაცხელების ძალიან დაბალი ტემპერატურა

—— გაზარდეთ გაჟღენთილი ტემპერატურა, რათა თავიდან აიცილოთ არასპეციფიკური წამოწყება და გაფართოება.

A-5 ოლიგონუკლეოტიდის ფრაგმენტების არასპეციფიკური გაძლიერება, რომელიც წარმოიქმნება დნმ-ის DNase დეგრადაციის შედეგად --— მაღალი ხარისხის რნმ-ის ამონაწერი დნმ-ის დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად.

RT-PCR არის რნმ-ის შებრუნებული ტრანსკრიფცია cDNA- ში, შემდეგ კი საპირისპიროდ გადაწერილი cDNA, როგორც შაბლონი PCR რეაქციისათვის, სამიზნე ფრაგმენტის გასაძლიერებლად. შეარჩიეთ შემთხვევითი პრაიმერები, Oligo dT და გენის სპეციფიური პრაიმერები ექსპერიმენტის სპეციფიკური პირობების შესაბამისად. ყველა ზემოაღნიშნული პრაიმერი შეიძლება გამოყენებულ იქნას მოკლე ევკარიოტული უჯრედის mRNA– სთვის თმის სამაგრის სტრუქტურის გარეშე.

შემთხვევითი პრაიმერი: ვარგისია გრძელი რნმ თმის სამაგრის სტრუქტურით, ასევე ყველა სახის რნმ – ით, როგორიცაა რრნმ, მრნმ, ტრნმ და ა.შ. ისინი ძირითადად გამოიყენება ერთჯერადი შაბლონის RT-PCR რეაქციისათვის.

Oligo dT: შესაფერისია რნმ -სთვის PolyA კუდით (პროკარიოტული რნმ, ეუკარიოტული ოლიგო დტ რრნმ და tRNA არ აქვთ პოლია კუდები). ვინაიდან Oligo dT უკავშირდება PolyA კუდს, რნმ-ის ნიმუშების ხარისხი უნდა იყოს მაღალი და მცირედი დეგრადაციაც კი მნიშვნელოვნად შეამცირებს სრულმეტრაჟიანი cDNA სინთეზის რაოდენობას.

გენის სპეციფიკური პრაიმერი: შაბლონის თანმიმდევრობის დამატება, შესაფერისი სიტუაციებისთვის, როდესაც სამიზნე მიმდევრობა ცნობილია.

არსებობს ორი გზა:

1. შიდა მითითების მეთოდი: თეორიულად cDNA არის სხვადასხვა სიგრძის დნმ -ის ფრაგმენტები, ამიტომ ელექტროფორეზის შედეგია ნაცხი. თუ რნმ -ის სიმრავლე დაბალია, არცერთი პროდუქტი არ გამოჩნდება ელექტროფორეზში, მაგრამ ეს არ ნიშნავს იმას, რომ არცერთი პროდუქტი არ გაძლიერდება PCR– ით. ზოგადად, შიდა მითითება შეიძლება გამოყენებულ იქნას cDNA– ს გამოსავლენად. თუ შიდა მითითებას აქვს შედეგები, cDNA- ს ხარისხი შეიძლება იყოს გარანტირებული (ზოგიერთ შემთხვევაში, თუ სამიზნე გენის ფრაგმენტი ძალიან გრძელია, შეიძლება არსებობდეს გამონაკლისები).

2. თუ არსებობს ცნობილი თარგი გაძლიერებული ამ შაბლონით, მისი გადამოწმება შესაძლებელია ამ გენის პრაიმერების მიერ. შიდა მითითების გაძლიერება სულაც არ ნიშნავს იმას, რომ cDNA– სთან პრობლემა არ არის. იმის გამო, რომ შიდა მითითებას cDNA– ში დიდი სიმრავლე აქვს, მისი გაძლიერება ადვილია. თუ cDNA ნაწილობრივ დეგრადირებულია სხვადასხვა მიზეზის გამო, ალბათობის თვალსაზრისით, დაბალი სიმრავლის სამიზნე გენების PCR შედეგები დიდ გავლენას მოახდენს. მიუხედავად იმისა, რომ შინაგანი მითითება ჯერ კიდევ მაღალია, გაძლიერება ალბათ არ იმოქმედებს.

რნმ -ის ნაწილობრივ დეგრადაცია. გამოავლინეთ მთლიანობა და გაწმინდეთ რნმ

სხვადასხვა სახეობის რნმ შინაარსი შეიძლება განსხვავებული იყოს, მაგრამ ზოგადად, მოპოვებული მთლიანი რნმ უნდა შეიცავდეს ორ გამჭვირვალე 28S და 18S ბენდს გელის ელექტროფორეზში, ხოლო ყოფილი ზოლის სიკაშკაშე უნდა იყოს ორჯერ მაღალი ვიდრე ამ უკანასკნელის. 5S ზოლი მიუთითებს, რომ რნმ -ს დეგრადაცია აქვს და მისი სიკაშკაშე პროპორციულია დეგრადაციის ხარისხთან. შიდა მითითების წარმატებული გაძლიერება არ ნიშნავს იმას, რომ არ არსებობს პრობლემა რნმ -თან, რადგან შინაგანი მითითება დიდი რაოდენობითაა, რნმ შეიძლება გაძლიერდეს მანამ, სანამ დეგრადაცია არ იქნება მძიმე. OD₂₆₀/OD₂₈₀სპექტროფოტომეტრით გაზომილი სუფთა რნმ -ის თანაფარდობა უნდა იყოს 1.9 -დან 2.1 -მდე. მცირე რაოდენობით ცილის მინარევები რნმ -ში შეამცირებს თანაფარდობას. სანამ მნიშვნელობა არ არის ძალიან დაბალი, RT არ იმოქმედებს. რაც ყველაზე მნიშვნელოვანია RT– სთვის არის RNA მთლიანობა.

შიდა საცნობარო გენის გაფართოებამ შეიძლება მხოლოდ მიუთითოს, რომ RT წარმატებულია, მაგრამ ეს სულაც არ არის დაკავშირებული cDNA ძაფის ხარისხთან. ვინაიდან შიდა საცნობარო ფრაგმენტები ზოგადად მცირე ზომის და გამოხატვის მაღალია, ისინი უფრო ადვილად ხდებიან წარმატებული საპირისპირო ტრანსკრიპციაში. თუმცა, სამიზნე გენის ზომა და გამოხატულება განსხვავდება გენიდან გენის მიხედვით. CDNA- ს ხარისხი არ შეიძლება შეფასდეს მხოლოდ შიდა მითითებით, განსაკუთრებით 2 კბ -ზე მეტი სამიზნე ფრაგმენტებისთვის.

ზოგიერთ ნიმუშს აქვს რთული მეორადი სტრუქტურა, ან აქვს მდიდარი GC შემცველობა, ან ძვირფასია მცირე რაოდენობით. ამ შემთხვევებში, შესაბამისი საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა უნდა შეირჩეს სამიზნე ფრაგმენტისა და ნიმუშის ზომის მიხედვით. RNA შაბლონებისთვის მაღალი GC შემცველობით და რთული მეორადი სტრუქტურით, ძნელია მეორადი სტრუქტურის გახსნა დაბალ ტემპერატურაზე, ან საერთო საპირისპირო ტრანსკრიპტაზით. ამ შაბლონებისთვის შესაძლებელია Quant Reverse Transcriptase- ის არჩევა, ვინაიდან მისი საპირისპირო ტრანსკრიფციის შესრულება აშკარად უკეთესია ვიდრე M-MLV სერიის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რომელსაც შეუძლია რნმ-ის სხვადასხვა შაბლონის ეფექტურად გადაბრუნება და რნმ-ის გადაწერა cDNA- ს პირველ ზოლში მაქსიმალურად. ზოგადი საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას ნაკრების გამოყენებისას, 20 μl სისტემას შეუძლია მხოლოდ ეფექტურად შეცვალოს მთლიანი რნმ -ის 1 მკგ. გთხოვთ მიაქციოთ ყურადღება ნაკრების მაქსიმალურ RT ტევადობას. თუ თარგი ზედმეტად დაემატა, საპირისპირო ტრანსკრიფცია ხელს შეუწყობს რნმ -ს მაღალი სიჭარბით. ამიტომ, უმჯობესია არ გადააჭარბოს სისტემის მაქსიმალურ სიმძლავრეს.

A-1 დაადგინეთ, არის თუ არა RNA მკვეთრად დეგრადირებული და არის თუ არა RT წარმატებული

ზოგადად, შიდა საცნობარო გაძლიერების მიზეზი ხშირად გამოწვეულია რნმ -ის სერიოზული დეგრადაციით. კიდევ ერთი შესაძლო მიზეზი არის საპირისპირო ტრანსკრიფციის უკმარისობა. შიდა მითითება არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც სტანდარტი cDNA ერთი შტრიხის ხარისხის განსასაზღვრად, მაგრამ ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც სტანდარტი იმის განსასაზღვრად, არის თუ არა საპირისპირო ტრანსკრიფცია წარმატებული, თუ არ არსებობს რნმ ხარისხის პრობლემა. საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესში ყველაზე მნიშვნელოვანი ის არის, რომ შევინარჩუნოთ მუდმივი ტემპერატურა და მუდმივი რეაქციის სისტემა რეაქციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.

A-2 განსაზღვრავს რამდენად საიმედოა პრაიმერები შიდა საცნობარო გენების გასაძლიერებლად და არის თუ არა პრობლემა PCR– ში გამოყენებულ რეაქტივებში.

შედარებითი რაოდენობრივი განსაზღვრისათვის, რნმ უნდა იყოს რაოდენობრივი საპირისპირო ტრანსკრიფციამდე, რაც ასევე საჭიროა ბევრ საპირისპირო ტრანსკრიფციის კომპლექტში, მაგალითად, რნმ შეყვანის რაოდენობრივად 1 მკგ. ვინაიდან საპირისპიროდ გადაწერილი cDNA არის შერეული ხსნარი, მათ შორის RNA, oligo dT, ფერმენტი, dNTP და მცირეოდენი დნმ -ის ნარჩენებიც, მოხდება გადახრა, ამიტომ შეუძლებელია cDNA– ს ზუსტი რაოდენობა. აქედან გამომდინარე, აუცილებელია რნმ -ის რაოდენობრივი განსაზღვრა. იმის გათვალისწინებით, რომ საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა ერთიდაიგივეა სხვადასხვა ნიმუშებს შორის, მიღებული cDNA- ის რაოდენობა უნდა იყოს იგივე და რაოდენობრივმა ანალიზმა შეიძლება აჩვენოს სხვადასხვა გენის გამოხატვის დონის შედარება საერთო რნმ -ის ერთსა და იმავე რაოდენობაში. ფარდობითი ფლუორესცენციის რაოდენობრივი PCR შესრულებისას, რაოდენობრივი cDNA შეიძლება არ იყოს საჭირო საპირისპირო ტრანსკრიფციის შემდეგ, რადგან შიდა საცნობარო გენი შეიძლება იქცეს როგორც მითითება.

ის ძირითადად გენებთან არის დაკავშირებული და გრძელი ფრაგმენტის საპირისპირო ტრანსკრიფცია შეუძლებელია გენების უმეტესობისთვის. ჯერ ერთი, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა გაცილებით დაბალია ვიდრე PCR. მეორეც, GC მდიდარი რეგიონი და მრავალი გენის მეორადი სტრუქტურა ზღუდავს როგორც საპირისპირო ტრანსკრიპციას, ასევე PCR- ს. დაბოლოს, PCR– ის ერთგულების და გაძლიერების ეფექტურობა ერთდროულად რთულია გარანტირებული. საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესში ვერავინ იძლევა გარანტიას დაბალი ფრაგმენტის გენების ხანგრძლივი ფრაგმენტის მისაღებად, განსაკუთრებით oligo dT- ის გამოყენებით. რაც შეეხება 5 'UTR უფრო GC– ით, ეს კიდევ უფრო რთულია. ამრიგად, ეს ჯერ კიდევ გონივრული მეთოდია შემთხვევითი პრაიმერებით ტრანსკრიპციის გადაბრუნება, სამიზნე ფრაგმენტში ბუნებრივი განხეთქილების ადგილების პოვნა, სეგმენტების გაძლიერება და შემდგომ შეზღუდვის მონელების და ლიგატების შესრულება. ზოგადად, ძნელია 2 კბ -ზე მეტი ზომის ფრაგმენტების გაძლიერება, მაგრამ მისი მიღება ყოველთვის შეუძლებელია: 1. უპირველეს ყოვლისა, გარანტირებული იყოს რნმ/მრნმ -ის მთლიანობა და სასურველია ტრიზოლის მოპოვება. 2. M-MLV RT-PCR ნაკრები შეიძლება გამოყენებულ იქნას უშუალოდ. გაახანგრძლივეთ გაცხელების დრო და გაზარდეთ ციკლის რაოდენობა ამპლიფიკაციის პროცესში სწორად. ალტერნატიულად, ჩადგმული PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას, ან განახორციელოს ერთი ან ორი რეაქცია, სათანადოდ გახანგრძლივებული დენატურაციისა და გაგრძელების დრო ნორმალური PCR ამპლიფიკაციის წინ, რამაც შეიძლება ხელი შეუწყოს ფრაგმენტების გაფართოებას. ყურადღება მიაქციეთ პოლიმერაზის ერთგულებას. 3.Long Taq შეიძლება გამოყენებულ იქნას PCR– ში იდეალური შედეგის მისაღებად. 4. ცილის გამოხატვის გამოყენებისათვის უნდა იქნას გამოყენებული მაღალი ერთგულების პოლიმერაზა.

არსებობს ორი სახის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რომელსაც გთავაზობთ TIANGEN: Quant/King RTase და TIANScript M-MLV. მათ შორის მთავარი განსხვავება არის შაბლონების შეყვანის რაოდენობა. Quant არის უნიკალური საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რომელიც განსხვავდება Moloney თაგვის ლეიკემიის ვირუსისგან მიღებული M-MLV– სგან. Quant არის ახალი მაღალი ეფექტურობის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რომელიც რეკომბინენტულად გამოიხატება საინჟინრო Escherichia coli– ით. Quant შესაფერისია 50 ng-2 μg რნმ-ის გასაძლიერებლად მაღალი უკუ ტრანსკრიპციული აქტივობით და მაღალი მოსავლიანობით. ჩვეულებრივ MMLV– სთან ან AMV– სთან შედარებით, Quant– ის ყველაზე დიდი მახასიათებელია ის, რომ მას აქვს ძალიან ძლიერი კავშირი RNA შაბლონებთან და შეუძლია შეცვალოს ტრანსკრიფციის რთული შაბლონები მაღალი ტემპერატურის დენატურაციის გარეშე. GC– ს უფრო მაღალი შემცველობის შაბლონებისთვის, საპირისპირო ეფექტურობა უფრო მაღალია. თუმცა, ამ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას აქვს RNase H აქტივობა, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს cDNA პროდუქტის სიგრძეზე (ვარგისი <4.5 kb შაბლონებისთვის). ჩვეულებრივი საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის რეკომენდებულია TIANScript MMLV საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა. ეს RTase არის მოდიფიცირებული ფერმენტი ძალიან სუსტი RNase H აქტივობით, რომელიც შესაფერისია cDNA– ს ხანგრძლივი (> 5 კბ) სინთეზისთვის.

ერთსაფეხურიანი საპირისპირო ტრანსკრიფცია და PCR გაძლიერება სრულდება ერთსა და იმავე მილში cDNA სინთეზსა და გაძლიერებას შორის მილის საფარის გახსნის გარეშე, რაც ხელს უწყობს დაბინძურების შემცირებას. ვინაიდან მიღებული cDNA ყველა ნიმუში გამოიყენება ამპლიფიკაციისთვის, მგრძნობელობა უფრო მაღალია, სულ მცირე 0.01 pg მთლიანი რნმ -ით. წარმატებული ერთსაფეხურიანი RTPCR, გენების სპეციფიკური პრაიმერები ზოგადად გამოიყენება cDNA სინთეზის დასაწყებად. ორეტაპიანი მეთოდი, კერძოდ საპირისპირო ტრანსკრიფცია და PCR გაძლიერება ხორციელდება ორ საფეხურად. ჯერ საპირისპირო ტრანსკრიფცია ხორციელდება რნმ -ის შაბლონიდან cDNA- ის მისაღებად და მიღებული cDNA ექვემდებარება ერთ ან მეტ განსხვავებულ PCR რეაქციას. ორსაფეხურიან მეთოდს შეუძლია გამოიყენოს ოლიგო (dT) ან შემთხვევითი პრაიმერები cDNA– ს პირველი ნაწილის სინთეზის დასადგენად და შეუძლია შეცვალოს ყველა mRNA ინფორმაცია კონკრეტული ნიმუშიდან.