TIANSeq RNA Frag/cDNA სინთეზის მოდული

ამჟამად, მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგია ძირითადად ემყარება შემდეგი თაობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგიას. იმის გამო, რომ მომდევნო თაობის თანმიმდევრობის ტექნოლოგიის კითხვის ხანგრძლივობა შეზღუდულია, ჩვენ უნდა გავყოთ მთლიანი სიგრძის თანმიმდევრობა მცირე ფრაგმენტულ ბიბლიოთეკებად მიმდევრობით. თანმიმდევრობის განსხვავებული ექსპერიმენტების საჭიროებების მიხედვით, ჩვენ, როგორც წესი, ვირჩევთ ერთჯერადი თანმიმდევრობას ან ორმხრივ თანმიმდევრობას. ამჟამად დნმ-ის ფრაგმენტები მომდევნო თაობის თანმიმდევრობის ბიბლიოთეკაში, ძირითადად, განაწილებულია 200-800 bp დიაპაზონში.

ა) დნმ დაბალი ხარისხისაა და შეიცავს ინჰიბიტორებს. გამოიყენეთ დნმ-ის მაღალი ხარისხის ნიმუშები, რათა თავიდან აიცილოთ ფერმენტების აქტივობა.

ბ) დნმ-ის ნიმუშის რაოდენობა არასაკმარისია PCR– თავისუფალი მეთოდის გამოყენებით დნმ ბიბლიოთეკის შესაქმნელად. როდესაც ფრაგმენტული დნმ-ის შეყვანა 50 ნგ-ს აღემატება, PCR- ის გარეშე მუშაობის პროცესი შეიძლება შერჩევითად განხორციელდეს ბიბლიოთეკის მშენებლობის პროცესში. თუ ბიბლიოთეკის ასლის ნომერი ძალიან დაბალია, რომ მოხდეს პირდაპირი თანმიმდევრობა, დნმ ბიბლიოთეკის გაძლიერება შესაძლებელია PCR– ით ადაპტერის ლიგირების შემდეგ.

გ) რნმ -ის დაბინძურება იწვევს დნმ -ის საწყის რაოდენობრივ არაზუსტ რაოდენობას რნმ -ის დაბინძურება შეიძლება არსებობდეს გენომური დნმ -ის გამწმენდის პროცესში, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს დნმ -ის არაზუსტი რაოდენობრივი და არასაკმარისი დნმ დატვირთვა ბიბლიოთეკის მშენებლობის დროს. რნმ -ის ამოღება შესაძლებელია რნაზით მკურნალობით.

A-1

ა) ჩნდება მცირე ფრაგმენტები (60 bp-120 bp) მცირე ფრაგმენტები ჩვეულებრივ არის ადაპტერის ფრაგმენტები ან დიმერები, რომლებიც წარმოიქმნება გადამყვანების მიერ. Agencourt AMPure XP მაგნიტური მძივებით გაწმენდას შეუძლია ეფექტურად ამოიღოს ეს ადაპტერის ფრაგმენტები და უზრუნველყოს თანმიმდევრობის ხარისხი.

ბ) ბიბლიოთეკაში დიდი ფრაგმენტები ჩნდება PCR გაძლიერების შემდეგ ბიბლიოთეკის დნმ -ის ფრაგმენტის ზომა ადაპტერის ლიგირების შემდეგ გაიზრდება 120 ბპ -ით. თუ დნმ -ის ფრაგმენტი ადაპტერის ლიგირების შემდეგ იზრდება 120 ბპ -ით მეტი, ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს ზედმეტი PCR ამპლიფიკაციის არანორმალური ფრაგმენტის გაძლიერებით. PCR ციკლის რაოდენობის შემცირებამ შეიძლება თავიდან აიცილოს სიტუაცია.

გ) ბიბლიოთეკის დნმ -ის ფრაგმენტების არანორმალური ზომა ადაპტერის ლიგირების შემდეგ ამ ნაკრებში ადაპტერის სიგრძეა 60 bp. როდესაც ფრაგმენტის ორი ბოლო შეუერთდება გადამყვანებს, სიგრძე მხოლოდ 120 ბპ – ით გაიზრდება. ამ აპარატის გარდა სხვა ადაპტერის გამოყენებისას, გთხოვთ, დაუკავშირდეთ მიმწოდებელს, რათა მოგაწოდოთ შესაბამისი ინფორმაცია, როგორიცაა ადაპტერის სიგრძე. გთხოვთ, დარწმუნდეთ, რომ ექსპერიმენტის სამუშაო ნაკადი და ოპერაცია მიჰყვება სახელმძღვანელოში აღწერილ ნაბიჯებს.

დ) დნმ -ის ფრაგმენტის არანორმალური ზომა ადაპტერის შეკავშირებამდე ამ პრობლემის მიზეზი შეიძლება გამოწვეული იყოს დნმ -ის ფრაგმენტაციის დროს არასწორი რეაქციის პირობებით. განსხვავებული რეაქციის დრო უნდა იქნას გამოყენებული დნმ -ის სხვადასხვა შეყვანისთვის. თუ დნმ-ის შეყვანა 10 ნგ-ზე მეტია, ჩვენ გირჩევთ აირჩიოთ რეაქციის დრო 12 წთ, როგორც ოპტიმიზაციის საწყისი დრო, ხოლო ამ დროს წარმოებული ფრაგმენტის ზომა ძირითადად 300-500 ბპ-ის ფარგლებშია. მომხმარებლებს შეუძლიათ გაზარდონ ან შეამცირონ დნმ-ის ფრაგმენტები 2-4 წუთის განმავლობაში საკუთარი მოთხოვნების შესაბამისად, რათა მოხდეს დნმ-ის ფრაგმენტების ოპტიმიზაცია საჭირო ზომებით.

A-2

ა) დაქუცმაცების დრო ოპტიმიზირებული არ არის რეაქციის სისტემა გაახანგრძლივებს ან შეამცირებს 3 წთ -ს ფრაგმენტაციის დროზე უფრო ზუსტი კორექტირების მიზნით.

A-3

დნმ -ის არანორმალური ზომის განაწილება ფრაგმენტაციის მკურნალობის შემდეგ

ა) ფრაგმენტაციის რეაქტივის გაყინვის არასწორი მეთოდი, ან რეაქტივი მთლიანად არ არის შერეული გალღობის შემდეგ. გაყინეთ ყინულზე 5 × ფრაგმენტაციის ფერმენტის ნაზავის რეაგენტი. გალღობისთანავე, თანაბრად აურიეთ რეაგენტი მილის ფსკერზე ნაზად მორევით. არ დააბრუნოთ რეაგენტი!

ბ) დნმ -ის შეყვანის ნიმუში შეიცავს EDTA- ს ან სხვა დამაბინძურებლებს მარილის იონებისა და ჩელატური აგენტების ამოწურვა დნმ -ის გამწმენდ საფეხურზე განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია ექსპერიმენტის წარმატებისთვის. თუ დნმ დაიშალა 1 × TE- ში, გამოიყენეთ ფრაგმენტაციის შესასრულებლად ინსტრუქციაში მოცემული მეთოდი. თუ EDTA კონცენტრაცია ხსნარში გაურკვეველია, რეკომენდირებულია დნმ -ის გაწმენდა და მისი დაშლა დეიონიზირებულ წყალში შემდგომი რეაქციისათვის.

გ) არაზუსტი დნმ -ის საწყისი კვანტიფიკაცია ფრაგმენტირებული დნმ -ის ზომა მჭიდროდაა დაკავშირებული დნმ -ის შეყვანის რაოდენობასთან. ფრაგმენტაციის დამუშავებამდე, დნმ -ის ზუსტი რაოდენობრივი განსაზღვრა Qubit, Picogreen და სხვა მეთოდების გამოყენებით აუცილებელია რეაქციის სისტემაში დნმ -ის ზუსტი რაოდენობის დასადგენად.

 დ) რეაქციის სისტემის მომზადება არ ასრულებს ინსტრუქციას ფრაგმენტული რეაქციის სისტემის მომზადება უნდა განხორციელდეს ყინულზე მკაცრად ინსტრუქციის შესაბამისად. საუკეთესო ეფექტის უზრუნველსაყოფად, რეაქციის ყველა კომპონენტი უნდა განთავსდეს ყინულზე და რეაქციის სისტემის მომზადება უნდა განხორციელდეს სრული გაგრილების შემდეგ. მომზადების დასრულების შემდეგ, გთხოვთ, დააწკაპუნოთ ან პიპეტით, რომ საფუძვლიანად აურიოთ. ნუ მორევ!

1. შერევის არასათანადო მეთოდი (მორევა, ძალადობრივი რხევა და სხვა) გამოიწვევს ბიბლიოთეკის ფრაგმენტების არანორმალურ განაწილებას (როგორც ეს მოცემულია ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში), რაც გავლენას მოახდენს ბიბლიოთეკის ხარისხზე. ამიტომ, ფრაგმენტული მიქსის რეაქციის ხსნარის მომზადებისას, გთხოვთ ნაზად შეანჯღრიოთ პიპეტით ზემოთ და ქვემოთ, ან გამოიყენეთ თითის წვერი, რომ გადაათრიოთ და თანაბრად აურიოთ. ფრთხილად იყავით, რომ არ შეურიოთ მორევს.

2. მაღალი სიწმინდის დნმ უნდა იქნას გამოყენებული ბიბლიოთეკის მშენებლობისათვის

DNA დნმ -ის კარგი მთლიანობა: ელექტროფორეზის ზოლი 30 კბ -ზე მეტია, კუდის გარეშე

OD260/230:> 1.5

OD260/280: 1.7-1.9

3. დნმ -ის შეყვანის ოდენობა უნდა იყოს ზუსტი. დნმ -ის რაოდენობრივი შესაფასებლად რეკომენდებულია Qubit და PicoGreen მეთოდების გამოყენება და არა ნანოდროპის.

4. დნმ – ის ხსნარში EDTA– ს შემცველობა უნდა განისაზღვროს EDTA– ს აქვს დიდი გავლენა ფრაგმენტაციის რეაქციაზე. თუ EDTA- ს შემცველობა მაღალია, დნმ -ის გამწმენდი უნდა ჩატარდეს შემდგომ გამოცდამდე.

5. ფრაგმენტაციის რეაქციის ხსნარი უნდა მომზადდეს ყინულზე ფრაგმენტაციის პროცესი მგრძნობიარეა რეაქციის ტემპერატურისა და დროის მიმართ (განსაკუთრებით გამაძლიერებლის დამატების შემდეგ). რეაქციის დროის სიზუსტის უზრუნველსაყოფად, გთხოვთ მოამზადოთ რეაქციის სისტემა ყინულზე.

6. ფრაგმენტაციის რეაქციის დრო ზუსტი უნდა იყოს ფრაგმენტაციის საფეხურის რეაქციის დრო უშუალოდ იმოქმედებს ფრაგმენტის პროდუქტების ზომაზე, რაც გავლენას მოახდენს ბიბლიოთეკაში დნმ -ის ფრაგმენტების ზომის განაწილებაზე.

1. რა ტიპის ნიმუში გამოიყენება ამ ნაკრებისთვის?

ამ ნაკრების მოქმედი ნიმუშის ტიპი შეიძლება იყოს მთლიანი რნმ ან გაწმენდილი mRNA კარგი რნმ მთლიანობით. თუ მთლიანი რნმ გამოიყენება ბიბლიოთეკის შესაქმნელად, რეკომენდებულია rRNA გამოფიტვის ნაკრების გამოყენება (კატა#4992363/4992364/4992391) რრნმ -ის ამოღების მიზნით.

2. შესაძლებელია თუ არა FFPE ნიმუშების გამოყენება ბიბლიოთეკის შესაქმნელად ამ ნაკრებით?

FFPE ნიმუშებში mRNA იქნება დეგრადირებული გარკვეულწილად, შედარებით ცუდი მთლიანობით. ბიბლიოთეკის მშენებლობისთვის ამ ნაკრების გამოყენებისას რეკომენდებულია ფრაგმენტაციის დროის ოპტიმიზაცია (ფრაგმენტაციის დროის შემცირება ან ფრაგმენტაციის შეუსრულებლობა).

3. პროდუქტის სახელმძღვანელოში მოცემული ზომის შერჩევის საფეხურის გამოყენებით, რამ შეიძლება გამოიწვიოს ჩასმული სეგმენტის უმნიშვნელო გადახრა?

ზომის შერჩევა უნდა განხორციელდეს ამ პროდუქტის სახელმძღვანელოში ზომის შერჩევის ნაბიჯის მკაცრი დაცვით. თუ არსებობს გადახრა, მიზეზი შეიძლება იყოს ის, რომ მაგნიტური მძივები არ არის დაბალანსებული ოთახის ტემპერატურაზე ან სრულად არ არის შერეული, პიპეტი არ არის ზუსტი ან სითხე რჩება წვერში. ექსპერიმენტისთვის რეკომენდებულია რჩევების გამოყენება დაბალი ადსორბციით.

4. ადაპტერების შერჩევა ბიბლიოთეკის მშენებლობაში

ბიბლიოთეკის სამშენებლო ნაკრები არ შეიცავს ადაპტერის რეაგენტს და რეკომენდებულია მისი გამოყენება TIANSeq ერთჯერადი ინდექსის ადაპტერთან ერთად (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. ბიბლიოთეკის ხარისხი

ბიბლიოთეკის რაოდენობრივი გამოვლენა: Qubit და qPCR გამოიყენება ბიბლიოთეკის მასის და მოლური კონცენტრაციის დასადგენად. ოპერაცია მკაცრად შეესაბამება პროდუქტის სახელმძღვანელოს. ბიბლიოთეკის კონცენტრაცია ზოგადად დააკმაყოფილებს NGS თანმიმდევრობის მოთხოვნებს. ბიბლიოთეკის განაწილების დიაპაზონის გამოვლენა: Agilent 2100 ბიოანალიზატორის გამოყენებით ბიბლიოთეკის განაწილების დიაპაზონის გამოსავლენად.

6. გამაძლიერებელი ციკლის ნომრის შერჩევა

ინსტრუქციის თანახმად, PCR ციკლების რაოდენობაა 6-12, ხოლო საჭირო PCR ციკლების რაოდენობა უნდა შეირჩეს ნიმუშის შეყვანის მიხედვით. მაღალპროდუქტიულ ბიბლიოთეკებში, ჩვეულებრივ, სხვადასხვა ხარისხით ხდება გაძლიერება, რაც ვლინდება ოდნავ დიდი პიკით სამიზნე დიაპაზონის პიკის შემდეგ Agilent 2100 ბიოანალიზატორის გამოვლენისას, ან Qubit- ის გამოვლენილი კონცენტრაცია უფრო დაბალია, ვიდრე qPCR. რბილი გაძლიერება ნორმალური მოვლენაა, რომელიც არ იმოქმედებს ბიბლიოთეკის თანმიმდევრობასა და მონაცემთა შემდგომ ანალიზზე.

7. Spikes ჩნდება Agilent 2100 Bioanalyzer- ის გამოვლენის პროფილში

Agilent 2100 ბიოანალიზატორის გამოვლენისას ნაპერწკლების გამოჩენა ხდება ნიმუშების არათანაბარი ფრაგმენტაციის გამო, სადაც გარკვეული ზომის მეტი ფრაგმენტი იქნება, და ეს უფრო აშკარა გახდება PCR გამდიდრების შემდეგ. ამ შემთხვევაში, ვარაუდობენ, რომ არ მოხდეს ზომების შერჩევა, ანუ დადგინდეს ფრაგმენტაციის მდგომარეობა 94 ° C- მდე 15 წუთის განმავლობაში ინკუბაციის დროს, სადაც ფრაგმენტის განაწილება მცირეა და კონცენტრირებული და ერთგვაროვნების გაუმჯობესება შესაძლებელია.