2 × GC მდიდარი PCR მიქსი

A-1 შაბლონი

■ შაბლონი შეიცავს ცილის მინარევებს ან Taq ინჰიბიტორებს და სხვ. —— გაასუფთავეთ დნმ შაბლონი, ამოიღეთ ცილის მინარევები ან ამოიღეთ დნმ შაბლონი გამწმენდი ნაკრებებით.

Temp შაბლონის დენატურაცია არ არის სრულყოფილი —— სათანადოდ გაზრდის დენატურაციის ტემპერატურას და ახანგრძლივებს დენატურაციის დროს.

■ შაბლონის დეგრადაცია —— შაბლონის ხელახლა მომზადება.

A-2 პრაიმერი

Prim პრაიმერების დაბალი ხარისხი-პრაიმერის ხელახალი სინთეზი.

■ პრაიმერის დეგრადაცია - მაღალი კონცენტრაციის პრაიმერების მცირე მოცულობად გადანაწილება შესანახად. მოერიდეთ მრავალჯერადი გაყინვას და გალღობას ან 4 ° C ხანგრძლივ კრიოპრეზერვაციას.

Prim პრაიმერების არასწორი დიზაინი (მაგ. პრაიმერის სიგრძე არ არის საკმარისი, დიმერი ჩამოყალიბებულია პრაიმერებს შორის და ა.შ.)

A-3 მგ²⁺კონცენტრაცია

G მგ²⁺ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია —— სათანადოდ გაზრდის მგ – ს²⁺ კონცენტრაცია: ოპტიმიზაცია Mg²⁺ კონცენტრაცია რეაქციების სერიით 1 მმ -დან 3 მმ -მდე 0.5 მმ ინტერვალით ოპტიმალური მგ -ის დასადგენად²⁺ კონცენტრაცია თითოეული შაბლონისა და პრაიმერისთვის.

A-4 გამოცხობის ტემპერატურა

Ne გაცხელების მაღალი ტემპერატურა გავლენას ახდენს პრაიმერისა და შაბლონის შეკავშირებაზე. --— შეამცირეთ გაცხელების ტემპერატურა და გააუმჯობესეთ მდგომარეობა 2 ° C გრადიენტით.

A-5 გაგრძელების დრო

Extension გახანგრძლივების მოკლე დრო —— გაზარდეთ გაფართოების დრო.

ფენომენები: უარყოფითი ნიმუშები ასევე აჩვენებს სამიზნე მიმდევრობის ზოლებს.

PCR- ის A-1 დაბინძურება

Target სამიზნე მიმდევრობის ან ამპლიფიკაციის პროდუქტების ჯვარედინი დაბინძურება - სიფრთხილით არ მოხდეს პიპეტით ნეგატიურ ნიმუშში სამიზნე მიმდევრობის შემცველი ნიმუშის გადატანა ან ცენტრიფუგის მილებიდან. რეაგენტები ან აღჭურვილობა უნდა იყოს ავტოკლავირებული არსებული ნუკლეინის მჟავების აღმოსაფხვრელად, ხოლო დაბინძურების არსებობა უნდა განისაზღვროს უარყოფითი კონტროლის ექსპერიმენტებით.

■ რეაგენტით დაბინძურება —— დატოვეთ რეაგენტები და შეინახეთ დაბალ ტემპერატურაზე.

A-2 Primer

G მგ²⁺ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია —— სათანადოდ გაზრდის მგ – ს²⁺ კონცენტრაცია: ოპტიმიზაცია Mg²⁺ კონცენტრაცია რეაქციების სერიით 1 მმ -დან 3 მმ -მდე 0.5 მმ ინტერვალით ოპტიმალური მგ -ის დასადგენად²⁺ კონცენტრაცია თითოეული შაბლონისა და პრაიმერისთვის.

Prim პრაიმერის არასათანადო დიზაინი და სამიზნე მიმდევრობას აქვს ჰომოლოგია არა სამიზნე მიმდევრობასთან. —— პრაიმერების ხელახალი დიზაინი.

ფენომენები: PCR გამაძლიერებელი ზოლები შეუსაბამოა მოსალოდნელ ზომასთან, დიდი ან პატარა, ან ზოგჯერ ხდება სპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები და არასპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები.

A-1 პრაიმერი

Prim პრაიმერის ცუდი სპეციფიკა

—— ხელახლა დიზაინის პრაიმერი.

■ პრაიმერის კონცენტრაცია ძალიან მაღალია - სათანადოდ გაზრდის დენატურაციის ტემპერატურას და ახანგრძლივებს დენატურაციის დროს.

A-2 მგ²⁺ კონცენტრაცია

M მგ²⁺ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია - Mg2+ კონცენტრაციის სწორად შემცირება: Mg ოპტიმიზაცია²⁺ კონცენტრაცია რეაქციების სერიით 1 მმ -დან 3 მმ -მდე 0.5 მმ ინტერვალით ოპტიმალური მგ -ის დასადგენად²⁺ კონცენტრაცია თითოეული შაბლონისა და პრაიმერისთვის.

A-3 თერმოსტაბილი პოლიმერაზა

En ფერმენტის ჭარბი რაოდენობა - ფერმენტის ოდენობის სათანადოდ შემცირება 0.5 U ინტერვალით.

A-4 გამოცხობის ტემპერატურა

■ გამოცხობის ტემპერატურა ძალიან დაბალია--სათანადოდ გაზარდეთ გაცხელების ტემპერატურა ან გამოიყენეთ ორეტაპიანი დადნობის მეთოდი

A-5 PCR ციკლი

PC ძალიან ბევრი PCR ციკლი —— შეამცირეთ PCR ციკლების რაოდენობა.

A-1 პრაიმერი—— ცუდი სპეციფიკა —— პრაიმერის ხელახალი დიზაინი, პრაიმერის პოზიციისა და სიგრძის შეცვლა მისი სპეციფიურობის გასაზრდელად; ან განახორციელოს ჩადგმული PCR.

A-2 თარგი დნმ

—— შაბლონი არ არის სუფთა —— გაასუფთავე თარგი ან ამოიღე დნმ გამწმენდი ნაკრებებით.

A-3 მგ²⁺ კონცენტრაცია

—— მგ²⁺ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია —— სათანადოდ შეამცირეთ მგ²⁺ კონცენტრაცია: ოპტიმიზაცია Mg²⁺ კონცენტრაცია რეაქციების სერიით 1 მმ -დან 3 მმ -მდე 0.5 მმ ინტერვალით ოპტიმალური მგ -ის დასადგენად²⁺ კონცენტრაცია თითოეული შაბლონისა და პრაიმერისთვის.

A-4 dNTP

—— dNTP– ების კონცენტრაცია ძალიან მაღალია —— სათანადოდ შეამცირეთ dNTP– ის კონცენტრაცია

A-5 გამოცხობის ტემპერატურა

—— ძალიან დაბალი დალუქვის ტემპერატურა —— სათანადოდ გაზარდეთ გაცხელების ტემპერატურა

A-6 ციკლი

—— ძალიან ბევრი ციკლი —— ციკლის ნომრის ოპტიმიზაცია

პირველი ნაბიჯი არის შესაბამისი პოლიმერაზის არჩევა. რეგულარული Taq პოლიმერაზა არ შეიძლება კორექცია 3'-5 'ეგზონუკლეაზის აქტივობის არარსებობის გამო, ხოლო შეუსაბამობა მნიშვნელოვნად შეამცირებს ფრაგმენტების გაფართოების ეფექტურობას. ამრიგად, რეგულარული Taq პოლიმერაზა ვერ ახერხებს 5 კბ -ზე მეტი სამიზნე ფრაგმენტების ეფექტურად გაძლიერებას. Taq პოლიმერაზა სპეციალური მოდიფიკაციით ან სხვა მაღალი ერთგულების პოლიმერაზით უნდა შეირჩეს გაფართოების ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად და ხანგრძლივი ფრაგმენტის გაძლიერების საჭიროებების დასაკმაყოფილებლად. გარდა ამისა, გრძელი ფრაგმენტების გაძლიერება ასევე მოითხოვს პრაიმერის დიზაინის შესაბამის კორექტირებას, დენატურაციის დროს, გაფართოების დროს, ბუფერულ pH- ს და სხვა. ჩვეულებრივ, პრაიმერები 18-24 bp– ით შეიძლება გამოიწვიოს უკეთესი მოსავლიანობა. შაბლონის დაზიანების თავიდან ასაცილებლად, 94 ° C ტემპერატურაზე დენატურაციის დრო უნდა შემცირდეს 30 წამამდე ან ნაკლები ციკლის განმავლობაში, ხოლო ტემპერატურის გაზრდის დრო 94 ° C- მდე გაძლიერებამდე 1 წუთზე ნაკლები. უფრო მეტიც, გაფართოების ტემპერატურის დადგენა დაახლოებით 68 ° C- ზე და გაფართოების დროის დაპროექტება 1 კბ/წთ სიჩქარის მიხედვით შეუძლია უზრუნველყოს გრძელი ფრაგმენტების ეფექტური გაძლიერება.

PCR- ის გაძლიერების შეცდომის მაჩვენებელი შეიძლება შემცირდეს დნმ -ის სხვადასხვა პოლიმერაზას მაღალი ერთგულების გამოყენებით. ყველა Taq დნმ პოლიმერაზას შორის, რაც აქამდე იქნა ნაპოვნი, Pfu ფერმენტს აქვს ყველაზე დაბალი შეცდომის მაჩვენებელი და ყველაზე მაღალი ერთგულება (იხ. თანდართული ცხრილი). ფერმენტების შერჩევის გარდა, მკვლევარებს შეუძლიათ კიდევ უფრო შეამცირონ PCR მუტაციის მაჩვენებელი რეაქციის პირობების ოპტიმიზაციით, მათ შორის ბუფერული შემადგენლობის ოპტიმიზაციით, თერმოსტაბილური პოლიმერაზის კონცენტრაციით და PCR ციკლის ნომრის ოპტიმიზაციით.